四种可溶性载体对骨形态发生蛋白在小鼠体内诱导成骨活性的影响
李亚非 胡蕴玉 吕荣 王纪保

摘要 以四种可溶性物质作为牛骨形态发生蛋白(bBMP)的载体, 通过实验观察哪种物质是bBMP的有效缓释载体。将聚乙烯吡烷酮(PVP)、葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)、甘露醇分别与等量bBMP复合后,注射入小鼠股部肌肉,观察组织学成骨及测定标本内钙含量。结果,bBMP/PVP有良好成骨,吸收较快,未见炎症及排斥反应,其混悬液较稳定,具有良好的适针性及可注射性,bBMP/甘露醇只有很低成骨率。 其余各组未见成骨。PVP对bBMP具有满意助溶、助悬及缓释载体作用,对bBMP活性无损害, 生物相容性好。
关键词 骨形成 骨形态发生蛋白 载体 小鼠
作者单位:710032, 西安, 第四军医大学西京医院骨科研究所(李亚非, 现在北京军区总医院骨科,100700;胡蕴玉、吕荣);全军药理研究中心(王纪保)

生物因子的研究近年来很受重视。某些生物因子水溶性不良, 需要具有助溶助悬作用的载体来改善其溶解度或混悬液稳定性。而水溶性强的因子在体内可被体液迅速转运或降解,难以有效发挥作用,也需要有缓释延效功能的可溶性载体。本实验以PVP、葡聚糖、HES、甘露醇作为bBMP的载体,植入小鼠肌肉,观察它们对部分纯化bBMP成骨活性及溶解度的影响。目的在于筛选对部分纯化bBMP具有助溶助悬，缓释延效的载体,同时要求该载体无抗原性、易排泄,有利于bBMP活性的保持和增强、适针性及可注射 性良好，价廉易得。

材料与方法

一.bBMP的制备: 按Urist的方法[1],从新鲜小牛皮质骨中提取bBMP, 经小鼠肌袋植入实验证实其高度骨诱导活性。
二.载体: 共选用了4 种载体,载体实验分组与处理见表。另设立4 种单独载体组,剂量与实验组相同。
三.bBMP与载体的复合: 按每支注射剂内所含bBMP与载体的量及各组样本数,计算各组bBMP及载体的剂量。取定量的bBMP,溶于适量4M盐酸胍/0.05M氯化钙溶液中,对水透析24小时,4℃。得乳白色混悬液。将该bBMP液均分成4份,分别将粉状载体加入bBMP液, 搅拌, 使载体全部溶解。再将各组药液分装入青霉素小瓶。启动冷冻干燥机，待板层温度达-50℃时,将药瓶装入冻干仓冻干。 真空压盖, 60钴辐照灭菌 , 剂量为2KGry。4℃保存备用。上述bBMP与载体液,仅bBMP/PVP在20 分钟内未出现明显沉淀, 余4组均在静置5-8分钟后出现沉淀。4 种单独载体也同法冻干。
冻干品以PVP为载体时为白色有均匀微孔的海绵状, 加水后极易成乳白色混悬液。以甘露醇、葡聚糖、羟乙基淀粉为载体时, 冻干品也为白色海绵状, 但加水后溶解速度慢于PVP, 需加以振摇, 3分钟内溶解。
四.动物与植入: 昆明小鼠96只, 随机分为8组, 每组12只, 采用经皮注射的方法将bBMP与载体注入4组小鼠股部肌肉内。取0.3ml生理盐水溶解bBMP/载体, 药液吸入皮试注射器, 注射入小鼠股部远离股骨干的肌肉内。另4 组同法注射各种载体液。注射毕以棉球轻压针眼1分钟。分笼饲养。各组于注射后10天处死6只, 取出注射点的硬结标本, 10%福尔马林固定,常规石蜡包埋, HE染色, 光镜下观察。于21天时各组处死6只, 清除标本表面肌肉, 切取1/2块标本称重, 匀浆后以5,000rpm离心,沉淀物以盐酸消化后干原子吸收分光光度计测钙含量。另1/2块标本同上法处理 , 脱钙后石蜡包埋, 组织切片,光镜下检查。

结果

附表显示bBMP和载体注射后组织学检查结果和钙含量。10天时,bBMP/PVP 组有新生软骨, 植入的bBMP和载体的周围部份开始被吸收, 被新生软骨替代, 但中心部位仍残留植入物(图1)。bBMP/PVP组新生软骨量多而密集, 而bBMP/甘露醇组虽有新生软骨, 但软骨细胞稀疏成骨率很低。在bBMP/葡聚糖组和bBMP/羟乙基淀粉组未见成骨,单独注入PVP组, PVP部分被吸收, 周围包绕纤维结缔组织未见炎症反应(图2)。而甘露醇已接近完全吸收, 未见炎症反应。在单独注入葡聚糖与羟乙基淀粉组, 植入物部分吸收, 残留物呈颗粒状, 有轻度炎症反应(图3)。

注射后21天, 组织学检查显示植入的bBMP/PVP已近完全被吸收, 被含有红骨髓的新骨替代, 仅个别标本中心残留很少量植入物(图4)。 未见慢性炎症反应或异物反应。bBMP/甘露醇组成骨率很低。21天时所有的对照植入物已完全被吸收, 反映成骨量的钙含量测定显示, 钙含量以bBMP/PVP组为最高,各组的钙含量见附表。

讨 论

多种骨生长因子在体内促进成骨作用的发挥, 都有赖于与适宜的载体缓释系统结合。否则骨生长因子(如纯化bBMP)极易被体液稀释转运吸收, 或被迅速降解。(2) 对固体性载体(如同种或异种骨,人工多聚体, 羟基磷灰石等)的研究较多, 对可溶性载体的研究很少,(3) 而可溶性载体对骨生长因子的实验研究及临床应用都有重要作用, 特别是某些水溶性较差的骨生长因子以混悬注射液方式给药或进行体外研究时,适宜的载体更是必不可少的。除了对载体的一般要求外,如缓释作用, 不引起炎症和排斥反应, 易吸收等,(2)还要求这类载体有良好水溶性及助溶助悬作用, 不降低骨生长因子活性。 
PVP、葡聚糖、羟乙基淀粉等溶于水后形成胶体液 ,在生物分子表面形成表面膜,其亲水基向外,疏水基向内,即所谓缔合胶团,起助溶作用,同时这类物质具有吸附药物的作用,随载体的代谢和排泄逐渐释放吸附药物。
本实验结果显示, bBMP/葡聚糖组与bBMP/羟乙基淀粉组,未能诱导成骨,bBMP/ 甘露醇组成骨率很低, 而bBMP/PVP组有良好骨诱导作用。我们以往的实验证实单纯植入0.5mg bBMP(无载体),不能诱导成骨,所以提示PVP缓释载体延效增效作用。PVP可较快被完全吸收, 鉴于BMP的骨诱导作用主要在3周之内完成的, 这样的吸收速度是满意的,避免了某载体吸收慢,阻碍新骨替代长入的缺点。bBMP/PVP加水后迅速成为混悬液,且稳定时间较其它各组长, 组织中未见炎症及免疫排斥反应,具有良好的适针性和可注射性,可满足实验研究及临床应用的要求。
PVP是由纯化的1-2烯-2-吡咯烷酮的30%～60%水溶液,在氨或胺存在下, 以过氧化氢为催化剂进行交链均聚后提纯所得。(4)本品水溶液具有一定粘度,有增稠、助悬、助溶、分散、络合等特点和作用,还可作血浆扩容剂,或冷冻医学器官移植时细胞的冷冻保护剂。(5)10%～20% PVP溶液,可使青霉素,可的松,胰岛素等药物缓释延效.(4)PVP在体内不参与代谢, 静注中分子量PVP(25000～100000),由肾脏在第1个24小时内排出70%。PVP无抗原性,安全无毒, LD50>100g/kg(大鼠,经口)。(4)PVP能稳定生物大分子并防止其变性,这一作用可能是PVP与分子和生物大分子以氢键结合, 相互作用。(7)该特点有利于BMP活性的保护。 
由于PVP显示对多种药物及对局部细胞增殖有作用的生物因子有缓释载体作用 , 因此PVP可能并不只限于作bBMP的载体。TGF-β、PDGF、FGF及EGF及某些细胞因子,有促进创伤区细胞增殖,促进骨修复或血管增殖作用。PVP也可能是这些生物活性物质有效载体。载体的分子量可能会影响它们的特性,(2)包括生物相容性, 生物降解性等, 本实验中HES, 葡聚糖, 甘露醇均只采用一种分子量,如果采用不同分子量的载体与bBMP复合, 可能会表现出不同的成骨活性。因此尚不能说HES,葡聚糖, 甘露醇不是bBMP的适宜载体。可采用不同分子量的上述物质进行活性实验。


表. 实验处理与成骨结果
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载体 分子量 bBMP 成骨率 钙含量(p<0.01)
(mg) (平均) (mg) ─────── (μg/mg湿组织) 
n 10天 20天 20天
────────────────────────────────
PVP 70,000 0.5 12 5/6 6/6 9±0.22 
(25)
葡聚糖 15,000 0.5 12 0/6 0/6 0
(25)
HES 120,000 0.5 12 0/6 0/6 0
(25)
甘露醇 128.17 0.5 12 1/6 2/6 2.2±0.21
(25) 
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注 (1)载体与bBMP为每支注射剂内所含剂量
(2)单纯植入各载体的对照组未列入上表


参考文献
1.Urist MR,Lietze A,Mizutani H,et al.A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein(BMP)fraction.Clin Orthop,1982,162:219.
2.Miyamoto S,Takaoka K,Okada T,et al.Polylactic acid-polyethylene glycol block copolymer: A new biodegradable synthetic carrier for bone morphogenetic protein.Clin Orthep,1993.294:333.
3.Lucas PA, Layrencin C, Syftestad GT, et al. Ectopic induction of cartilage and bone by water-soluble protein from bovine bone using a polyanhydride vehicle.J Biomed Mater Res,1990,24:901.
4.罗明生,高天惠 主编.药剂辅料大全.成都:四川科技出版社,1993,805.
5.刘金刚,刘作斌 主编.低温医学,北京:人民卫生出版社,1993,79-85.
6.柏乃庆 主编.人体保存-细胞、组织和器官保存技术.上海:上海科技出版社,1985 ,303-304.
7.Klotz IM,Russell JW. The effect of urea on the configuration of polyvinylpyrrolidone.JPhysical Chemistry,1961,65:1274.
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