胸髓横断大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽表达的变化及意义
李亚非 姚建华 时述山 李增洲 张立仁 梁毅

摘要

目的：了解脊髓损伤后胫骨骨折骨痂内降钙素基因相关肽（CGRP）的变化。方法：64只Wistar大鼠随机分成8组，4组造成大鼠胸10—11段脊髓横断+右胫骨骨折；4组为单纯右胫骨骨折动物模型。术后3天、7天、14天、21天分组处死动物，取血测ALP，骨痂行组织学检查和CGRP免疫组化染色。动物处死前摄X线片进行双盲评分。结果：脊髓损伤动物在各个时间点ALP均显著升高；21天时X线评分脊髓损伤动物分值高。镜下观察：脊髓损伤动物均形成大量纤维骨痂和软骨骨痂，编织骨形成少，存在骨化障碍， CGRP免疫阳性神经纤维较少，但骨祖细胞胞浆内出现CGRP阳性表达。结论：①脊髓横断动物模型较单纯神经切断术缺神经程度更高，可能更适合于失神经骨折愈合的研究。②脊髓损伤后CGRP阳性的骨痂大量增殖和ALP活性的增高，提示CGRP与成骨活动增强有关。骨痂骨化变慢可能与局部失神经支配后使骨折愈合方式发生变化有关，提示神经因素参与调节骨折愈合过程。
关键词 ： 脊髓损伤 胫骨 骨折 降钙素基因相关肽 
作者单位：北京军区总医院骨科（100700，北京，李亚非 姚建华 时述山 李增洲 张立仁 梁毅）
通讯作者：李亚非
本课题1998年获国家自然基金资助 

伴有中枢神经损伤的四肢骨折往往可以见到大量的骨痂过度生长，或中枢神经损伤后异位骨化的发生率可达20%-30%[1,2] ，提示神经因素可能参与了骨代谢的调节，但其机理尚不清楚。本研究采用大鼠脊髓横断加胫骨骨折的动物模型，研究不同时间点胫骨骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维的表达及其对骨痂生长和改建的影响。

1．材料与方法
1.1．动物模型的制备：成年雌性Wistar大鼠64只，体重300g—350g。随机分成8组，4组做成单纯右胫骨骨折模型，4组做成胸10—11段脊髓横断+右胫骨骨折模型。手术方法：10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，背部及右下肢脱毛，俯卧位背部消毒、铺巾，背部正中切口显露胸10—11段的脊髓，脊髓损伤组用尖刀将脊髓横断，切除约0.3cm脊髓，单纯骨折组不损伤脊髓，缝合背部伤口；仰卧位消毒右下肢，胫骨中段前正中切口，在胫骨前弓状缘上0.3cm处锯断胫骨，从胫骨内髁前侧顺行穿入一根1mm克氏针行髓内固定，缝合皮肤，伤口用25%火棉胶封后，右下肢用管形石膏固定于膝关节屈曲90°，踝关节伸直位。分笼饲养，自来水、标准固体饲料喂养，并保持12小时光亮和12小时黑暗，依次循环。术后每隔6小时给脊髓损伤的大鼠挤尿1次 。
1．2.标本的取材制作：分别于术后3天、7天、14天、21天处死动物，处死前用10%水合氯醛麻醉，患肢摄正侧位X线片,两名有十余年骨科工作经验的医师对X线片行双盲评价，评分标准按Nordsletten[6]提出的0—3分评定，小于1分为无骨痂形成。之后行断头取血，离心血清一部分查ALP，一部分冻存于－70°冰箱中，待以后测血清中神经肽变化；并立即取带少许肌肉的右胫骨固定于4%多聚甲醛中24小时，之后放入10%二乙胺四乙酸钠（EDTA）溶液中脱钙，每周换一次脱钙液，经3—4周脱钙，用针头能轻易扎穿骨皮质，则脱钙充分，拔除髓内针，骨折远、近端各保留0.5cm切取骨痂组织，自来水冲洗0.5小时，经系列酒精脱水、透明、浸蜡，用58°C石蜡包埋。切取5μm切片行HE染色，观察骨痂形成情况。
1．3.免疫组化染色：用石蜡切片机切取8μm厚组织铺于胶片上，65°C烤片3小时，用SP法行免疫组化染色，SP试剂盒购于迈新公司。CGRP一抗购于 CHEMICON INTERNATIONAL INC，工作浓度为1∶6000。操作步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，双氧水封闭内源性过氧化物酶15min，PBS洗3×5min；0.01mol/L柠檬酸缓冲液（PH6.0），MW4档修复抗原2min后再用MW5档修复抗原2×5min，PBS洗3×5min；用5%正常羊血清封闭10min，加CGRP一抗放于4°C冰箱中24小时，从冰箱中取出室温下放置20min，PBS洗3×5min；加二抗37°C、30min，PBS洗3×5min；加三抗37°C、30min，PBS洗3×5min；DAB—H2O2显色2—3分钟，苏木素复染，脱水、透明、封片。实验中省去一抗者为阴性对照，脊髓组织切片为阳性对照。

2． 结 果
　　2．1．ALP变化：单纯胫骨骨折和脊髓损伤+胫骨骨折动物在不同时间组的ALP值见表。单纯胫骨骨折和脊髓损伤+胫骨骨折动物模型各时间组ALP均增高，但后者在不同的时间组ALP升高均较前者明显（P＜0.01）。
　　2．2．骨痂X线片观察：3天组、7天组在单纯胫骨骨折和脊髓损伤+胫骨骨折两种动物模型中X线片均无骨痂可见，14天组似有骨痂形成，但判断不可靠，未比较，21天组单纯胫骨骨折7例1分，1例2分，而脊髓损伤+胫骨骨折2例3分，3例2分，1例1分，说明脊髓损伤动物骨痂生成量多。
　　2．3．组织学观察：
　　 2．3．1． 3天时脊髓损伤动物骨折区外骨膜增厚，单纯骨折动物无此现象。
　　 2．3．2． 7天时脊髓损伤动物骨折区纤维骨痂量较多，其间有散在的软骨细胞团形成，外骨膜增厚明显，且形成增殖软骨团。单纯骨折动物纤维骨痂量少，纤维骨痂中也有散在软骨细胞团，外骨膜轻度增厚，但有少许编织骨形成。
　　 2．3．4． 14天组脊髓损伤动物仍有大量纤维骨痂，其间的软骨细胞团增大，有的融合在一起，但软骨内骨化形成编织骨量少，外骨膜下增生的软骨团骨化慢。单纯骨折动物纤维骨痂少，软骨团内骨基质形成，少量软骨细胞转化为骨细胞，外骨膜直接形成编织骨。
　　 2．3．5． 21天组脊髓损伤动物仍可见大量纤维骨痂，软骨团多见，其内有少许编织骨形成，外骨膜软骨团向骨细胞转化慢，单纯骨折动物骨痂已基本转化为骨性骨痂，大量的编织骨填充于骨折间隙，内外骨痂均少。
2．4．免疫组化观察：
　　 2．4．1．单纯骨折3天时骨膜有CGRP免疫阳性神经纤维，7天时骨痂中软骨细胞周围有少许CGRP免疫阳性神经纤维，内外骨膜成骨细胞、骨祖细胞和破骨细胞浆内CGRP阳性，14天时在编织骨的边缘有CGRP免疫阳性神经纤维，成骨细胞浆内CGRP阳性，21天组连接骨痂中的CGRP免疫阳性神经纤维减少，而内外骨痂中的神经纤维增多，内骨痂编织骨间的空隙增大，破骨细胞浆内CGRP阳性。
　　2．4．2．脊髓损伤+胫骨骨折3天时，外骨膜骨祖细胞浆内CGRP弱阳性，髓腔内有散在基质细胞CGRP呈阳性，骨膜无CGRP免疫阳性神经纤维。7天时外骨膜增厚明显，骨祖细胞、成骨细胞和软骨母细胞浆内CGRP强阳性，髓腔内有大量基质细胞CGRP阳性，纤维骨痂中偶可见CGRP免阳性神经纤维在软骨细胞团周围，软骨细胞浆内CGRP阳性。14天组外骨膜及髓腔内CGRP阳性细胞强度减弱，骨痂中软骨细胞团中央软骨细胞CGRP阴性，周边阳性，少量编织骨周围有少许成骨细胞CGRP弱阳性，偶可见少量CGRP免疫阳性神经纤维。21天组上述细胞内CGRP阳性只存在于少量成骨细胞（编织骨周围）和软骨团周边较幼稚的软骨细胞，骨膜及骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维极少。

3.讨 论
临床实践中发现中枢神经系统损伤患者伴随的四肢骨折，骨痂往往过度增生[1]，甚至形成异位骨化，许多学者产生了研究神经系统与骨代谢关系的浓厚兴趣。本世纪30年代以来，发现骨组织中有来自骨膜的神经末梢，分布于小血管或骨细胞周围。起初认为这种神经分布与痛觉的传递和骨的血流调节有关。后来进一步研究发现，切断大鼠胫骨骨折侧的坐骨神经，可使其骨痂生成量及骨密度明显增加。近年研究显示，在鼠长骨骨化中心、骨膜、骨髓及骨痂中，有多种肽能神经如降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）、小肠血管活性肽（VIP）、神经肽Y（NPY）和酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化阳性末梢分布，这些纤维有密集的膨体，大多数走行于骨细胞之间，但与骨细胞是否有突触的接触和神经递质的传递，尚不清楚。同时也有研究显示骨不连组织中缺乏神经纤维的分布。一些学者在体外研究中发现，某些神经肽（如CGRP）可直接影响骨细胞的功能状态，刺激成骨细胞的增殖或抑制破骨细胞的骨吸收作用。
神经肽是广泛存在于人体中枢、周围神经及其它组织中的活性肽，是沟通细胞间与器官间的重要化学信使，有神经递质、神经调质和激素样作用。神经系统是否通过其神经肽递质来调节人体器官、组织、细胞包括骨细胞的代谢，已引起国外学者的极大关注。人体是一个整体，各系统之间不是孤立的，而是通过神经-免疫-内分泌之间相互调节，使人体各组织器官有机的联系起来。中枢神经系统的神经原细胞产生的神经肽递质沿轴浆转运到靶器官后，可直接调节靶细胞的功能，也可影响免疫细胞产生不同的细胞因子，影响内分泌系统产生不同的激素来调节靶细胞的功能，因此在组织细胞代谢过程中神经系统起着重要作用。目前国外学者已在周围神经损伤后对骨折愈合的影响及部分神经肽如SP、CGRP在体外细胞培养方面开展了工作，发现周围神经损伤后骨痂形成增多，骨痂内肽能神经减少，生物力学强度差；SP、CGRP可刺激成骨细胞集落形成。但中枢神经系统损伤后神经肽的变化及其对骨折愈合的影响尚未见报道。
3．1．关于动物模型
在动物实验中尚无中枢神经系统损伤对肢体骨痂生长影响的报道。神经损伤后轴浆转运的紊乱对骨痂生长的影响尚不清楚。对失神经状态下骨折愈合的研究，以往的研究主要集中在坐骨神经或坐骨神经加股神经切断后对大鼠骨折愈合的影响[4、5] ，但伴随着血管走行的交感神经仍可长入骨痂，切断周围神经并不能造成胫骨完全失神经支配，骨痂中仍有神经长入。但这两种动物模型不是可靠的完全丧失神经支配的模型[4、5]。
本实验采用T10—11段脊髓横断的动物模型，试图造成脊髓损伤下肢完全失神经模型。T10—11段脊髓横断可使T10平面以下感觉、运动神经功能丧失，同时也可使支配下肢的腰交感链丧失绝大部分功能，这相对于周围神经损伤来讲，脊髓损伤后胫骨缺神经程度更高。脊髓损伤+胫骨骨折动物模型较单纯神经切断术更适合于骨失神经后骨愈合的研究。但在损伤平面以下，神经仍有低级反射中枢存在，脊髓的背根神经节存在，虽然脊髓损伤后背根神经节内的神经元细胞会减少萎缩，但仍会有少许成活，它们仍可能产生CGRP和SP对骨折局部起作用，这需要进一步检测脊髓损伤平面以下背根神经节内CGRP和SP的变化。
3．2．脊髓横断后局部的CGRP的改变及其意义
关于神经因素影响骨代谢的因素，对降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）的研究较多。体外研究发现，CGRP可刺激成骨细胞的胶原和cAMP的合成。这种神经纤维主要分布在成骨活性较高的区域，如：干骺端、骨膜、骨髓，骨痂中也发现有CGRP免疫阳性神经纤维分布[5]，一般认为血液循环中的CGRP含量很低，CGRP可能通过CGRP阳性神经纤维轴浆转运到骨折局部释放，在骨痂形成和成熟过程中起重要的作用。研究还发现，CGRP免疫阳性神经纤维作用的靶细胞是干骺端的成骨细胞、破骨细胞和骨膜的衬里细胞，使成骨活动增强[7]。
本实验发现本研究在脊髓损伤动物，CGRP纤维主要分布于骨膜和软骨周围的纤维骨痂中，髓腔内也有散在网状分布，比单纯骨折动物骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维量要少，与文献报道相一致[5]。但脊髓损伤后3天时骨膜骨祖细胞、成骨细胞、破骨细胞、幼稚的软骨细胞和骨髓基质细胞浆内即出现CGRP阳性，7天时为强阳性，之后逐渐减弱，这在文献中尚未见报道。本实验还发现脊髓横断损伤动物血中反映成骨活动的ALP活性较单纯骨折动物高，提示CGRP参与着局部的骨代谢。但细胞浆内CGRP阳性物是从血中摄取的还是这些细胞在失神经后自身合成的，尚需进一步行血中神经肽的检测和原位杂交实验。
3．3．CGRP对骨痂量和成熟的影响 本实验显示脊髓横断损伤动物骨痂量大于单纯骨折动物骨痂量，但编织骨量却小于单纯骨折动物，提示脊髓横断损伤后骨痂的成熟障碍。 胚胎骨中神经纤维的长入与骨的矿化过程相平行[8]；Madsen等[5]采用大鼠坐骨神经加股神经切断，造成胫骨骨痂量增多，但骨痂中肽能神经纤维减少，骨痂生物力学强度降低，因此在骨痂形成和成熟过程中神经长入起非常重要的作用。实验中单纯骨折动物骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维多，纤维骨痂很快转化成骨性骨痂，骨膜成骨按膜内成骨方式，骨折修复快，骨痂量不多；而脊髓损伤动物骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维少，致使大量纤维骨痂中的软骨团软骨内骨化极慢，且膜内成骨方式改变成软骨内化骨过程；同时由于骨髓基质细胞、骨祖细胞、幼稚的软骨细胞浆内出现CGRP阳性表达，CGRP能促使这些细胞的增殖、分化[7]，使得大量的软骨细胞团形成，骨痂量较多，但骨痂停滞在纤维骨痂与软骨骨痂期。这可能是失神经后骨痂增殖但骨痂力学强度差的原因，提示神经因素也参与骨痂的改建过程。

本研究结果提示：①对骨失神经后骨愈合的研究，脊髓横断+胫骨骨折动物模型较单纯神经切断术缺神经程度更高。②脊髓损伤后骨膜骨祖细胞、成骨细胞和骨髓基质细胞浆内CGRP阳性，骨痂大量增殖，ALP增高，提示CGRP在局部参与着骨代谢。但尚需进行脊髓损伤后血清相关神经肽水平测定，和成骨细胞CGRP原位杂交研究，以了解脊髓损伤后CGRP的代谢过程③骨化过程的变慢，可能与局部失神经后缺乏负重等力学刺激，使骨折愈合方式发生变化有关。但有关神经因素影响骨代谢的详细机制尚需进一步研究。


参考文献
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