复合骨形态发生蛋白的磷酸盐人工骨促进兔骨缺损愈合
李亚非　时述山 姚建华 赵明 张立仁 常红星

摘要 目的 观察基因重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2），与α-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸钠复合物的成骨作用。材料与方法 将上述复合物植入小鼠肌肉内和兔桡骨缺损模型，观察促进骨折修复作用。结果 复合物植入小鼠肌肉后诱发异位骨化，12周修复兔桡骨缺损。未见明显排斥反应。结论rhBMP-2与α-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸钠的复合物具有满意成骨作用和修复骨缺损的潜力。

关键词：骨折，磷酸盐，骨形态发生蛋白，固化

本研究将基因重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2），与α-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸钠复合制备成可降解的有诱骨活性的生物性植骨材料，植入小鼠肌肉内和兔桡骨缺损模型，观察促进骨折修复作用。

材料与方法

1. 采用DNA重组技术,用含有人BMP-2全长cDNA的质粒,转入工程菌大肠杆菌中进行诱导表达,提取纯化基因重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)。获取物进行氨基酸序列分析并用免疫学方法进行抗原分析鉴定。经小鼠肌袋植入成骨实验证实其具有骨诱导活性。
2. α-磷酸钙/碳酸钙/磷酸钠人工骨配比的研究 选择最佳的配比。
3. 磷酸钙/碳酸钙/磷酸钠反应温度与pH值的研究 找到使骨形态发生蛋白的活性不受损害的配比。
4．小鼠肌袋植入成骨实验 　昆明小鼠16只。将含rhBMP-2 0.1mg的磷酸钠液与100mg磷酸钙/碳酸钙粉剂混合,在固化后植入8只小鼠一侧股部肌肉内。另外8只一侧股部肌肉内植入100mg磷酸钙/碳酸钙/磷酸钠液混合后的固化物。术后10天处死小鼠，立即取材切片，HE染色，光镜观察。rhBMP-2由军事医学科学院基础医学研究所生物化学研究室提供。
5．兔桡骨缺损修复实验　纯种大耳白兔16只，体重2.0～2.5公斤。无菌操作下，做兔双侧桡骨干中段连同骨膜的缺损1.5cm。将磷酸钙/碳酸钙粉剂1.0g与磷酸钠液+ rhBMP-2 1mg混合,在可塑期植入左侧桡骨缺损，作为实验组。固化后，严密缝合肌肉及皮肤。右侧桡骨缺损植入磷酸钙/碳酸钙粉剂1.0g与磷酸钠液混合物，作为对照。术后第5、12周时各处死8只兔。立即取下双侧尺桡骨，清除肌肉，X线拍片。再以10%中性福尔马林固定，制成脱钙明胶切片，纵切，厚10μm，HE染色，光镜观察。
　
结 果

1．小鼠肌肉诱导成骨实验 镜下可见，术后10天无炎细胞浸润及排斥反应，周围肌组织基本正常。可见新生软骨细胞及间充质细胞增殖，并有多处软骨岛形成，其间为新生的毛细血管。　　
2．兔桡骨缺损修复实验　　组织学检查，5周时，实验侧骨缺损处可见大片新生软骨性骨痂，植入物存在，但无明显炎细胞浸润及排斥反应。12周时，实验侧骨缺损内有成熟新骨和骨髓组织，新生骨与两断端连接、延续，并开始改建。植入物已近完全吸收。对照缺损区为纤维组织。
X线检查，实验侧5周时骨缺损区可见新生骨，12周时新骨量明显增多，在骨缺损中央部出现新骨。显示新骨桥接缺损。在对照侧形成骨不连，未能将缺损桥接。

讨 论

目前修复骨折、骨缺损主要采用自体骨、异体骨和等生物性植骨材料，或金属、高分子和羟基磷灰石等人造骨。自体骨移植易新骨替代，但给患者造成新的创伤，且骨量有限。异体骨移植需经各种理化处理降低抗原性，仍有可能引起免疫排斥反应，并有传播疾病的危险。金属类高分子类只能提供支架作用，均无骨诱导作用，而且作为异物存留体内。人工骨作为骨缺损的修复材料之一类，研究较多的是磷酸钙类的热烧结产物：如羟基磷灰石和磷酸三钙等。这类产品需要高温处理定型，多呈块状，形成高晶、高硬度的生物陶瓷。但有几个明显的缺点：不能术中赋型、不耐疲劳、无骨诱导活性降解困难。临床常可见到羟基磷灰石植入数年仍不能降解而影响新骨形成的例子。

Constantz等1995年于Science报道采用β-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸钠制备成可注射于骨折区的人工骨，并试用于新鲜的骨折病例。但这种材料只有新骨爬行替代的支架作用，无骨诱导能力。骨折延迟愈合或骨不连骨断端成骨活力多已处于抑制状态，单纯植入人工骨后成骨作用难以断定。而且β-磷酸三钙国内购不到，进口产品价昂贵。

骨形态发生蛋白（BMP），具有诱导骨骼肌中未分化的间充质细胞向软骨和骨分化的能力。Wozney等自1988年以来从人U-20S细胞等cDNA文库中克隆了10余个人BMPcDNA,目前以BMP-2研究最多。BMP很容易受热、酸碱度及多种理化因素影响失活,并有赖于载体缓释作用发挥骨诱导活性。目前国内外对采用何种方法、何种载体或剂型，何种给药途径,目前尚缺乏成熟的经验。有采用聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、及聚羟基脂肪酸酯等作为BMP载体,或BMP与羟基磷灰石等复合移植，虽然能改善成骨性能，但新骨量仍难以控制。也有报道采用石膏作为BMP载体，但反应过程产热，对BMP活性保持不利。

本研究将基因重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2），与国产α-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸钠复合制备成可降解的有诱骨活性的生物性人工骨。材料中α-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸钠等作为rhBMP-2的载体和成骨必须的基质，并有支撑，赋型作用。rhBMP-2诱导人工骨周围间充质细胞分化为软骨，从而通过软骨内化骨修复骨缺损。本品混合后5分钟即开始固化。可根据骨缺损形状、部位，在术中使用该人工骨塑型，填充、修复骨缺损。或与其他植骨材料混合后手术植入。经我们的实验观察，最后形成的碳磷酸盐晶体结构近似于正常，具有微孔。实验证实这种材料植入兔桡骨缺损后，新骨替代速度很快，可完全新骨替代、修复骨缺损。深入研究，可望开发出一种有满意骨修复能力的人工骨材料。

参考文献
1. Langer R et al. Tissue engineering. Science. 1993,260(14):920-925.
2. Alpaslan C et al.Long-term evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein -2 induce bone formation with a biologic and synthetic delivery system.British J oral and maxillofacial surgrry.1996,34:414.
3. Breitbart AS et al. Tissue engineered bone repair of calvarial defects cultured periosteal cells.Plastic and reconstructive surgery. 1998,101(3):567-581.
4. Constantz BR. Skeletal pepair by insitu formation of the mineral phase of bone. Science.1995,267(24):1796-1798.